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1. Quais são os principais parâmetros de desempenho que devem ser avaliados na validação de um método analítico?

Os principais parâmetros incluem:

• Linearidade: capacidade de obter resultados diretamente proporcionais à concentração do analito dentro de uma determinada faixa,
• Sensibilidade: capacidade de distinguir entre pequenas diferenças na concentração do analito,
• Faixa de Trabalho: intervalo de concentrações do analito que podem ser quantificadas com precisão e exatidão aceitáveis,
• Seletividade/Especificidade: capacidade do método de medir unicamente o analito de interesse na presença de outros componentes na matriz,
• Efeito de Matriz: influência da matriz da amostra na resposta do analito,
• Veracidade: proximidade dos resultados obtidos pelo método ao valor verdadeiro,
• Precisão: grau de concordância entre uma série de medições obtidas de múltiplas amostras sob condições especificadas, subdividida em Repetitividade, Reprodutibilidade Intralaboratorial e Reprodutibilidade Interlaboratorial,
• Limite de Decisão: CCα – concentração na qual se pode concluir, com uma probabilidade de erro α, que uma amostra contém o analito
• Capacidade de Detecção: CCβ – menor concentração que pode ser detectada com uma probabilidade de erro β,
• Incerteza de Medição: dispersão dos valores que podem ser razoavelmente atribuídos ao mensurando,
• Limite de Detecção (LD): menor quantidade de analito que pode ser distinguida do branco,
• Limite de Quantificação (LQ): menor quantidade de analito que pode ser quantificada com precisão e exatidão aceitáveis,
• Escopo/Aplicabilidade: tipos de amostras e matrizes para as quais o método é adequado,
• Robustez: capacidade do método de permanecer inalterado por pequenas variações deliberadas nos parâmetros do método
• Estabilidade: estabilidade do analito na matriz e em soluções padrão sob diversas condições.

2. Como a linearidade de uma curva de calibração é avaliada e qual a importância de se testar a homocedasticidade e a ausência de valores discrepantes (outliers)?

A linearidade é avaliada por meio de uma curva de calibração com pelo menos cinco concentrações e seis réplicas por nível. O ajuste dos dados é verificado por testes estatísticos, como o coeficiente de correlação (r) ou o coeficiente de determinação (R²).
A análise visual do gráfico de resíduos e a verificação da homocedasticidade (variância constante dos resíduos), por testes como o de Levene, são fundamentais.
Além disso, a identificação de outliers — que podem comprometer a curva — é feita com testes como o de Dixon ou pela análise do resíduo Studentizado.

3. Qual a diferença entre curvas de calibração matrizadas e não matrizadas e quando é necessário avaliar o efeito de matriz?

Uma curva de calibração não matrizada (CCAS) é preparada utilizando o analito em um solvente puro, enquanto uma curva de calibração matrizada (CCMBF ou CCEMBF) é preparada adicionando o analito a uma matriz branca (amostra sem o analito). O efeito de matriz é a influência dos componentes da matriz da amostra na resposta do analito. A avaliação do efeito de matriz é essencial quando a amostra possui matriz complexa que pode interferir na quantificação. Isso é feito comparando curvas de calibração matrizadas e não matrizadas por meio de testes estatísticos, como o teste F (variâncias) e o teste t de Student (interceptos e inclinações).
Se o efeito de matriz for significativo, a quantificação deve ser feita com curvas matrizadas ou por métodos que compensem essa interferência.

4. Como a veracidade de um método é determinada?

A veracidade, que expressa a proximidade dos resultados ao valor verdadeiro, é determinada por meio de ensaios com MRCs ou com amostras de matriz branca fortificadas com concentrações conhecidas do analito (ensaios de recuperação). Em ambos os casos, múltiplas réplicas em pelo menos três níveis de concentração são analisadas. A recuperação média deve estar dentro de limites aceitáveis, definidos por normas ou pela finalidade do método.

5. Qual a importância do uso de Materiais de Referência Certificados (MRCs)?

O uso de MRCs é fundamental, pois eles possuem valores de concentração do analito conhecidos e certificados por uma terceira parte competente, permitindo avaliar a tendência (vies) do método. Resultados obtidos com MRCs são comparados com seus valores certificados utilizando critérios estatísticos, como o erro relativo, o z-score ou o erro normalizado.

6. Quais são as diferentes medidas de precisão e como são avaliadas?

A precisão engloba: * Repetitividade: Precisão sob as mesmas condições de medição (mesmo analista, mesmo instrumento, mesmo laboratório, em um curto intervalo de tempo). É avaliada analisando-se múltiplas réplicas da mesma amostra e calculando-se o desvio padrão relativo (DPR ou CV) e o limite de repetitividade (r). * Reprodutibilidade Intralaboratorial (Precisão Intermediária): Precisão sob variações dentro do mesmo laboratório (dias diferentes, analistas diferentes, equipamentos diferentes). É avaliada repetindo-se os ensaios de repetitividade em diferentes dias e/ou com diferentes analistas/equipamentos, calculando-se o DPR global e o limite de reprodutibilidade intralaboratorial. * Reprodutibilidade Interlaboratorial: Precisão entre diferentes laboratórios, geralmente avaliada por meio de estudos colaborativos ou ensaios de proficiência. O documento foca na reprodutibilidade intralaboratorial, sendo avaliada de forma semelhante a repetitividade, mas considerando as variações internas ao laboratório.

7. Como são determinados o Limite de Detecção (LD) e o Limite de Quantificação (LQ) de um método analítico?

O LD pode ser estimado de diversas formas, como três vezes o desvio padrão do branco (obtido a partir de pelo menos 20 análises do branco) ou a partir da curva de calibração (intercepto mais três vezes o desvio padrão residual do ajuste). A verificação experimental do LD é recomendada, analisando-se amostras fortificadas no nível estimado do LD.

O LQ é estimado como um múltiplo do desvio padrão do branco (por exemplo, seis ou dez vezes) ou a partir da menor concentração fortificada validada com veracidade e precisão aceitáveis. Uma abordagem baseada em critérios de desempenho predefinidos para precisão (DPR) em concentrações próximas ao LQ também é utilizada. O documento sugere que o LQ seja adequado ao uso pretendido do método e que a incerteza de medição seja considerada ao redor desse limite.

8. Qual a importância dos estudos de robustez e como são realizados?

Os estudos de robustez são cruciais para avaliar a capacidade de um método analítico de não ser afetado por pequenas variações deliberadas nos parâmetros do método e fornecer uma indicação de sua confiabilidade durante o uso rotineiro. Esses estudos são realizados introduzindo-se pequenas alterações nas condições experimentais (por exemplo, variações na temperatura, pH, concentração de reagentes, tempo de reação, marca de coluna cromatográfica) e observando-se o efeito dessas alterações no desempenho do método (veracidade e precisão). Planejamentos fatoriais (completos ou fracionários) são frequentemente utilizados para avaliar o efeito de múltiplos fatores simultaneamente de forma eficiente. Os resultados dos estudos de robustez ajudam a identificar os parâmetros críticos que precisam ser rigorosamente controlados durante a aplicação do método.

9. Como a incerteza de medição analítica é estimada e qual a sua relevância?

A incerteza de medição é a estimativa da dispersão dos valores que podem ser atribuídos a um resultado analítico.
Pode ser calculada por duas abordagens:

• Bottom-up (GUM): considera incertezas de cada etapa do método (calibração, precisão, veracidade, etc.).
• Top-down: utiliza dados de validação interna e estudos de proficiência.

A incerteza permite avaliar a qualidade do resultado e sua conformidade com limites regulatórios, sendo expressa como incerteza expandida (normalmente com fator k = 2, para 95% de confiança).

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